Einführung und Grundbegriffe der Genetik
Durch die Ausweitung der Erkenntnisse über den genetischen Hintergrund verschiedener Krankheiten kommt es zu einer immer engeren Zusammenarbeit im Feld der medizinischen Genetik und Reproduktionsmedizin mit der assistierten Reproduktion und Embryologie. So ist eine neue Richtung der medizinischen Genetik entstanden – die Reproduktionsgenetik, die die weitere Entwicklung der präkonzeptionellen, Präimplantations- und klassischen pränatalen Diagnostik genetisch bedingter pathologischer Zustände zum Ziel hat, unter Anwendung der klassischen und molekularen Zytogenetik und Molekulargenetik. In Verbindung mit spezialisierter genetischer Beratung zielt die Reproduktionsgenetik auf eine komplexe medizinisch-präventive Pflege um das (Ehe-)Paar mit Reproduktionsstörungen ab.
Die Methoden der assistierten Reproduktion ermöglichen, den Wunsch nach einer Schwangerschaft und die Vorstellung einer kompletten Familie auch dann zu verwirklichen, wenn der natürliche Weg der Reproduktion versperrt ist. Dabei stellen Sterilität und Reproduktionsverluste andererseits auch einen wichtigen Selektionsmechanismus dar. Es ist bekannt, dass neben gynäkologischen, andrologischen, hormonellen und immunologischen Faktoren auch genetische Faktoren zur Ethiologie der Unfruchtbarkeit beitragen – monogene (Defekt in einem Gen), chromosomale und multifaktorelle (Zusammenwirken mehrerer Gene und Umweltfaktoren). Man nimmt an, dass genetisch bedingte Barrieren inklusive Chromosomen-Anomalien und Genmutationen bei 15 % der Männer und 10 % der Frauen mit Fruchtbarkeitsstörungen vorhanden sind. Einige genetische Faktoren – etwa Chromosomenaberration und Mutationen mancher Gene – sind bereits seit Jahren bekannt, bei anderen forscht man, ob sie an einen bestimmten Teil des Chromosoms gebunden sind, der Großteil bleibt jedoch unerforscht. Die Überbrückung genetischer Barrieren durch moderne Methoden der assistierten Reproduktion kann so auch die Übertragung genetisch bedingter Sterilität (Mikrodeletion am Y-Geschlechtschromosom), verschiedener Krankheiten (etwa zystische Fibrose, Hang zu Thrombose u.a.) und Syndrome (Chromosomen-Anomalien) auf die Nachkommen zu Folge haben.
Nach jahrelangen Bemühungen ist es dem Sanatorium Pronatal gelungen, mit diversen Versicherungsgesellschaften einen Vertrag über die Deckung von Leistungen der medizinischen Genetik inklusive Laboruntersuchungen abzuschließen. Dadurch konnte man die diagnostische und Heilpflege unfruchtbarer Paare um eine zusätzliche Abteilung für medizinische Genetik erweitern. Unsere Abteilung für medizinische Genetik wurde am 1.10.2002 eröffnet und steht unseren Patienten seitdem als spezielle Arbeitsstelle in den Bereichen der genetischen Beratung und Laboruntersuchungen zur Verfügung. Auf der Grundlage der einführenden genetischen Konsultation eines medizinischen Genetikers mit dem unfruchtbaren Paar inklusive genealogischer Analyse nehmen wir eine zytogenetische Untersuchung vor, an die eine DNA-Diagnostik auf Mutationen für zystische Fibrose im CFTR-Gen, auf Leiden-Mutation im Gen F5 für den plasmatischen Faktor FV und Mutation G20210A im Protrombin kodierenden Gen (Neigung zu Thrombose, spontanen Fehlgeburten und gynäkologischen Komplikationen) und Mikrodeletion im Y-Chromosom (niedrige Fertilität bis Unfruchtbarkeit des Mannes). Nach Vorliegen der Ergebnisse der zytogenetischen und molekulargenetischen Untersuchung wird das Paar vor der IVF über mögliche Risiken für ihre Nachkommen informiert und eine gezielte präimplantative qoder pränatale Gendiagnostik sichergestellt. So ist die Präimplantationsdiagnostik auf Chromosomen-Anomalien durch die FISCH Methode in einem frühen Embryonalstadium vor dem Transfer in die Gebärmutter bei uns bereits Routine. (Abb. 1).
(obr. 1) Risikopaar - Schema der genetischen Untersuchung des Paares mit Reproduktionsstörungen und PGD in Sanatorium Pronatal
Selbstverständlich werden auch Spender von Geschlechtszellen genetisch untersucht (genetische Konsultation, zytogenetische Konsultation und Untersuchung auf Mutationen des CFTR Gens für zystische Fibrose).
Gleichzeitig arbeiten wir an einer Verbesserung der medizinischen Vorgänge mit dem Ziel, die Palette der Untersuchungen auf weitere möglicherweise Unfruchtbarkeit bedingende Gendefekte zu erweitern, ebenso wie die Präimplantations- Gendiagnostik zur Untersuchung des Karotyps aus einer Embryonalzelle, die Bestimmung der Frequenz genetisch pathologischer Spermien durch die FISH-Methode bei schweren Störungen der Spermatogenese und zytogenetische Untersuchungen spontaner Fehlgeburten nach der Behandlung von Unfruchtbarkeit mit Methoden der assistierten Reproduktion.
Die menschliche DNA und Chromosome
Die Erbinformationen des Menschen sind in der Desoxyribonukleinsäure (DNA) gespeichert. Es geht um eine bestimmte Form eines Biomakromoleküls, das fähig ist, Informationen über Eigenschaften und Kennzeichen eines Menschen zu speichern. Die Abschnitte der DNA repräsentieren konkrete Gene, wobei jedes Gen eine genau bestimmte, spezifische Position in der DNA hat (Lokus).
Die DNA findet sich vor allem im Zellkern (Genom-DNA). Nur ein kleiner Teil liegt in kleinen Zellenorganelen – Mitrochondrien (mitrochondriale DNA) im Zytoplasma der Zellen. Die Genom-DNA befindet sich in allen Zellen mit Kern, mit Ausnahme ausgereifter roter Blutkörperchen – Erytrozyten, was einen praktische Bedeutung für die Entnahme von biologischem Material für die genetische Untersuchung hat.
Gemeinsam mit komplexen Eiweißen, RNA, Ionten und Enzymen bildet die DNA Chromatin. Durch vielmalige Kürzung der Chromatinstränge entstehen kleine Strukturen – Chromosome. Enthält das Chromatin ein aktives Gen, spricht man von Euchromatin. Einige Teile des Chromosoms bestehen allerdings auch aus Heterochromatin, der nichtaktive Gene beinhaltet. Das Heterochromatin unterscheidet sich in seinen funktionellen und färberischen Eigenschaften vom genetisch aktiven Euchromatin.
Ein normaler, gesunder Mensch besitzt in den somatischen Zellen (d.h. Körperzellen) 46 Chromosome. Davon bilden 22 Paare – also 44 Chromosomen - so genannte Autosome, und die zwei Geschlechtchromosome Genosome. Während eine Frau zwei XX-Geschlechtschromosome besitzt, verfügt der Mann über die Geschlechtschromosome X und Y. Das bedeutet, dass der physiologische weibliche Karotyp 46 XX ist (Abb.2) und der physiologische männliche Karotyp 46, XY (Abb. 3). Den Satz von 46 Chromosomen in der somatischen Zelle bezeichnet man als diploid.
(obr. 2) Weiblicher Karyotyp 46, XX
(obr. 3) Männlicher Karyotyp 46, XX
Bei der Zellteilung teilen sich die Chromosomen und somit auch die darin enthaltene genetische Information genau gleichmäßig in die neu entstehenden Zellen auf. In reifen Geschlechtszellen ist so nur der halbe Chromosomensatz, also 23, vorhanden, die als haploid bezeichnet werden. Alle normalen, gesunden Eizellen einer Frau tragen ein X-Chromosom, in ausgereiften Spermien eines Mannes befindet sich entweder ein X- oder ein Y-Chromosom. Da die somatischen (Körper-)Zellen des Menschen Chromosome in Paaren enthalten – Männer sind Ausnahmen – ist jedes Gen in zwei verschiedenen Formen vorhanden, die Allele genannt werden. Beide Allele können normal oder eventuell mutiert (beschädigt) sein oder ein Allel ist normal und das zweite mutiert. In den Geschlechtszellen ist nur ein Chromosom aus jedem Paar vorhanden, das ein – normales oder mutiertes - Allel trägt.
Bei Chromosomen unterscheidet man mehrere Abschnitte (Abb. 4). Jedes Chromosom verengt sich in einem Abschnitt, der primären Konstriktion, in der sich das Zentromer befindet. Dem Zentromer kommt bei der Zellteilung bei der Aufteilung der Chromosomen in die neuen Zellen eine wichtige Rolle zu. Das Zentromer teilt das Chromosom in zwei Teile – einen kurzen Arm (mit p bezeichnet) und einen langen Arm (bezeichnet q). Die Enden der beiden Chromosomenarme nennt man Telomere. Die akrozentrischen Chromosome Nr. 13, 14, 15, 21 und 22 beinhaltet neben einem Zentromer auch einen Bereich der sekundären Konstriktion, durch die vom kurzen Arm ein sehr kleiner Teil abgetrennt wird – ein Satellit. Die Verbindung zwischen dem kurzen Arm und dem Satelliten stellt eine dünne Brücke sicher. Dies ist der Ort, an dem sich ein kleiner Teil organisiert.
(obr. 4) Morphologie den Chromosomen
Die Teilung der Chromosome in einzelne Teile ist wichtig für die genaue Beschreibung von Chromosomen und darin auftretenden Veränderungen.
Chromosome unterscheiden sich untereinander durch ihre Größe, die Lage des Zentromers und ihre Streifen, die bei einer Färbung sichtbar werden. Der Färbevorgang ermöglicht es, die einzelnen Chromosome auseinander zu erkennen, ihre genaue Zahl zu bestimmen und Veränderungen in ihrer Struktur festzustellen (numerische und strukturelle Chromosomen-Anomalien). Mithilfe der konventionellen, homogenen Färbung färbt man ganze Chromosomen ein, die G- und R-Streifenmethode bringt ein System von hellen und dunklen Streifen hervor, wobei die R-Streifen als Negative der G-Streifen erscheinen. Durch die C-Streifung färbt man den Abschnitt des Zentromers aller und die heterochromatiden Teile mancher Chromosome. Weitere, seltener angewandte Färbemethoden bieten Lösungen in einigen spezifischen Situationen.
Die Anordnung der Chromosome eines Individuums oder seiner Zellen wird in der internationalen zytogenetischen Klassifikation als Karotyp bezeichnet.
Zytogenetische Untersuchungen
Die zytogenetische Untersuchung eines Karotyps ist ein aufwändiger Prozess, der nach der Arbeit eines Teams von Spezialisten verlangt (Abb. 5 – rechter Teil). Nach Abnahme von peripherem Blut (aus der Ader) kommt das genetische Material in das zytogenetische Labor. Hier werden die Zellen drei Tage lang in einem speziellen Medium kultiviert – einer Flüssigkeit, die alle für die Zellentwicklung und -teilung nötigen Nährstoffe enthält. Nach 72 Stunden Kultivierung fügt man zu den Zellen eine Flüssigkeit hinzu, die die Zellteilung im Stadium der Metaphase, gegebenenfalls auch Prometaphase stoppt. Durch die Wirkung der hypotonischen Flüssigkeit platzen die Zellen und das Zytoplasma wird entfernt. Nach der Fixierung tropft man die Zellensuspension auf einen Objektträger. Nachdem sie getrocknet ist, färbt man sie mit einer der Färbemethoden, standardmäßig der G-Streifenmethode, ein. Schließlich werden die Chromosomen mikroskopisch ausgewertet und der Karotyp der untersuchten Person bestimmt.
Molekulargenetische Untersuchung
Gendefekte – Mutationen – sind kleine Veränderungen, die unter dem Mikroskop nicht erkennbar sind. Ihr Auftreten wird mithilfe moderner molekulargenetischer Methoden untersucht (Abb. 5 – linker Teil). Nach Abnahme von peripherem Blut isoliert man aus den Blutzellen DNA. Daraus gewinnt man durch einen speziellen Vorgang – polymerisierte Kettenreaktion (aus dem Englischen PCR - polymerase chain reaction) – eine Vervielfältigung des DNA-Abschnitts, der untersucht werden soll. Je nach diagnostiziertem Mutationstypus spaltet man das Produkt der PCR-Reaktion durch Enzyme – restriktive Endonukleosen, die die spezifisch amplifizierten Fragmente in zwei Teile spalten. Danach werden die einzelnen Fragmente im elektrischen Feld auf Agarose- oder Polyakryl-Gel getrennt. Durch die Bestimmung der Fragmentgröße werden schließlich normale und mutierte Allele bestimmt.
(obr. 5) Schematische Darstellung der zytogenetischen und molekulargenetischen Untersuchung
